胰酶的配制方法
Hanks液是常見(jiàn)的平衡鹽溶液(BSS)之一。D-Hanks液則是無(wú)鈣鎂離子的Hanks液。BSS與細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)下的pH值、滲透壓及無(wú)菌狀態(tài)一致，且配方簡(jiǎn)單，是組織培養(yǎng)基本用液，常用于配制培養(yǎng)基及其他用液，或洗細(xì)胞等，細(xì)胞在BSS中可生存幾個(gè)小時(shí)。 胰蛋白酶(胰酸)溶液是一種常用的細(xì)胞消化液，原代培養(yǎng)時(shí)用于處理組織塊，使細(xì)胞分離下來(lái)。傳代時(shí)用胰蛋白酶使培養(yǎng)細(xì)胞離開(kāi)所貼附的培養(yǎng)瓶表面，并分散成單個(gè)細(xì)胞。胰蛋白酶主要采自?；蜇i的胰臟，呈白色粉末狀，易潮解，應(yīng)在低溫干燥處保存。胰酶的活力常用一份胰酶解離酪蛋白的份數(shù)表示，常用胰酶活力為1：125或1：250。一般來(lái)說(shuō)濃度大、溫度高(勿高于37℃)、作用時(shí)間長(zhǎng)，則對(duì)細(xì)胞分離能力大。但超過(guò)一定程度會(huì)損傷細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞傳代后不能貼壁或死亡。胰酶在pH 8.0、37℃時(shí)消化能力zui強(qiáng)。溶液中的Ca2+、Mg2+和血清會(huì)降低胰酶活力，所以配制胰酶時(shí)須用無(wú)Ca2+、Mg2+的D-Hanks液。當(dāng)消化結(jié)束時(shí)，可加入少量血清或含血清的培養(yǎng)基以終止胰酶作用。 細(xì)胞傳代使用的胰酶濃度是0．25％或0．2％。用于原代細(xì)胞培養(yǎng)消化組織塊則為0．1％或0．125％。
(一)配制D-Hanks液
1．按表2—3—5稱(chēng)取D-Hanks試劑。
2．依次加入上述試劑至800 mL蒸餾水中，溶解后定容至1 1000 mL。 3．高壓滅菌，10磅10 min。
(二)配制Hanks液
1．按表2—3—5稱(chēng)取Hanks試劑。
2．配制Hanks時(shí)，需將CaCl2另溶解于100 mL的蒸餾水中。
3．依次加入上述試劑至700 mL蒸溜水中，溶解后再與CaCl2溶液一起定容至1 000 mL。
4．10磅，10 min高壓滅菌。
(三)配制胰蛋白酶消化液
1．D．Hanks液高壓滅菌之后，晾至室溫，4℃保存?zhèn)溆谩?/div>
2．稱(chēng)取一定量胰蛋白酶粉末于研磨器中(夏天時(shí)研磨器應(yīng)放在冰浴中)，加入少量D－Hanks液研磨1 000次左右，調(diào)制成糊狀。再放入4℃預(yù)冷的適量D-Hanks液中，4℃下磁力攪拌使*溶解。
3．用NaHC03干粉將胰酶溶液的pH值調(diào)至8.0左右(胰酶作用的zui適pH值)，并加入0.02％EDTA以協(xié)助消化作用。
4．濾過(guò)除菌，－20℃凍存。
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